1.什么是RIPA裂解液？
RIPA裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay Lysis buffer，放射免疫沉淀法裂解緩沖液）是一種傳統(tǒng)的可用于裂解細(xì)胞或組織的快速裂解液，其原理為利用表面活性劑等裂解細(xì)胞膜（包括核膜），從組織或細(xì)胞中抽取可溶性蛋白。RIPA裂解液裂解后得到的蛋白一般可直接用于常規(guī)的WB、IP、co-IP等實(shí)驗(yàn)。
2.RIPA裂解液里有什么？
RIPA裂解液的配制方法有很多種，主要包括裂解成分、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑三種組分。裂解成分可通過破壞細(xì)胞膜和蛋白間的相互作用等方式裂解組織或細(xì)胞；蛋白酶抑制劑可有效抑制各類蛋白酶的活性，避免蛋白過度降解；磷酸酶抑制劑可有效抑制去磷酸化作用。
值得注意的是，由于RIPA裂解液中含有一些穩(wěn)定性相對(duì)較弱的酶類抑制劑，故應(yīng)放在-20℃保存。其中PMSF的穩(wěn)定性極弱，半衰期只有0.5 h，所以必須現(xiàn)配現(xiàn)用。
3.如何選擇合適的RIPA裂解液？
如果您只是要做普通的WB、IP或者co-IP，我們建議您使用免疫印跡及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液(20118)，該裂解液在裂解細(xì)胞或組織后一般不會(huì)形成粘滯的透明狀DNA團(tuán)塊，不必采用超聲處理就可進(jìn)行下一步操作。同時(shí)，該裂解液還適用于磷酸化蛋白的WB檢測(cè)。
如果使用免疫印跡及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液(20118)的效果不是很好，那您的蛋白可能比較特殊，我們建議您可以嘗試另外幾種裂解液。如果您的蛋白是難溶性的蛋白，建議您可以嘗試使用裂解強(qiáng)度更高的裂解液，如RIPA裂解液(強(qiáng)/中)；如果您在做IP實(shí)驗(yàn)的時(shí)候發(fā)現(xiàn)背景很高，即有很多非特異性蛋白被IP下來，這時(shí)候您需使用裂解強(qiáng)度較強(qiáng)的裂解液，比如RIPA裂解液(強(qiáng)/中)。反之，如果您發(fā)現(xiàn)目的蛋白無(wú)法IP下來，則說明您使用的裂解液強(qiáng)度過強(qiáng)，此時(shí)需使用裂解強(qiáng)度較弱的裂解液，比如RIPA裂解液(弱)。
4. RIPA裂解液適用于哪些細(xì)胞？
幾乎適用于所有實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞和各種組織。包括各種懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞及動(dòng)物組織等。
5. 如何判斷細(xì)胞的裂解程度？
細(xì)胞裂解：加入RIPA后，充分裂解的細(xì)胞，沒有細(xì)胞沉淀，很粘稠。如果像渾濁的水一樣粘性很小則可能是裂解液得量加太多導(dǎo)致的；相反，如果RIPA裂解液后出現(xiàn)膠狀物體，離心不能沉淀則可能是蛋白太多，RIPA裂解液加入的量太少導(dǎo)致的。
組織裂解：先將組織剪成細(xì)小的碎片，之后利用勻漿器或超聲破碎的方法，鏡檢顯示細(xì)胞破碎率大于90%，同時(shí)組織已經(jīng)完全裂解，沒有明顯的小組織塊。之后按照細(xì)胞裂解的步驟進(jìn)行裂解，裂解程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)與細(xì)胞裂解一致。
RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則需通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測(cè)一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB、p53等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子。
6. RIPA儲(chǔ)存出現(xiàn)白色沉淀，為什么？
一般是由于裂解液中SDS在儲(chǔ)存的時(shí)候沉淀析出導(dǎo)致，這時(shí)只需將裂解液放置于37℃水浴加熱后恢復(fù)室溫即可使用。
7. RIPA裂解液可以獲得細(xì)胞中的不同蛋白嗎？
RIPA裂解液提取的是全蛋白，包括核蛋白、漿蛋白、膜蛋白等。如果要提取特定的蛋白（如：核蛋白、膜蛋白）則可利用專門提這類蛋白的試劑盒進(jìn)行提取。
遠(yuǎn)慕在這里給出的建議僅供大家參考，具體裂解液的選擇和使用，還需要根據(jù)您自己的實(shí)驗(yàn)需求和實(shí)驗(yàn)效果選擇適合您實(shí)驗(yàn)的RIPA裂解液。
8.RIPA裂解液的使用方法
如發(fā)現(xiàn)RIPA有沉淀，請(qǐng)放室溫半小時(shí)或者常溫水浴使沉淀溶解。
根據(jù)使用量，取每1ml RIPA 加入10ul PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM?；靹騻溆?（PMSF現(xiàn)用現(xiàn)加）。
1.樣品前處理：
a)對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用 PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。按照 6 孔板每孔細(xì)胞量加入150-250 ul裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。
b)對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照 6 孔板每孔細(xì)胞量加入 150-250 ul 裂解液的比例加入裂解液，再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬(wàn)細(xì)胞/管，然后再裂解。
c)對(duì)于組織樣品： 把組織剪切成細(xì)小的碎片。按照每20mg組織加入150-250 ul裂解液的比例加入裂解液。 (如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量)。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
2.后處理：
將裂解后的樣品10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
注意事項(xiàng) ：
強(qiáng)烈型裂解液，可以提取核蛋白，但在提取核蛋白的同時(shí)，也會(huì)將基因組一并釋放出來，造成細(xì)胞裂解液粘稠，此時(shí)可以直接加入蛋白上樣緩沖液，煮沸再離心，離心后直接上樣電泳；若想測(cè)定濃度，可入加少量 SDS（1%），煮沸后離心測(cè)濃度。本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑，所以不適合使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，請(qǐng)選擇BCA法或者Lowry法檢測(cè)蛋白濃度。
